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吉林省森林铁路路外伤亡事故处理暂行规定

时间:2024-07-22 00:54:55 来源: 法律资料网 作者:法律资料网 阅读:9791
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吉林省森林铁路路外伤亡事故处理暂行规定

吉林省人民政府


吉林省森林铁路路外伤亡事故处理暂行规定
吉林省人民政府



为了保证森林铁路(以下简称森铁)行车安全正点和人民生命财产安全,妥善处理森铁列车与其他车辆(含拖拉机、爬犁)碰撞和森铁路外人员(含非正在岗位执行任务的森铁职工和未持有效乘车凭证的旅客)伤亡事故,特制定本规定。
第一条 凡森铁列车(含轨道车)在运行和调车作业中,发生撞轧行人、牲畜,与其他车辆碰撞等情况,招致人员、牲畜伤亡或车辆破损,均列为路外伤亡事故。
第二条 森铁职工要认真执行规章制度,防止路外伤亡事故。森铁列车乘务人员必须认真了望,鸣笛示警;道口看守工要坚守岗位,尽职尽责;无人看守的道口,必须做到护桩、法定警告标志齐备,清晰醒目。凡因防护设施不全,或森铁职工失职造成的路外伤亡事故,由森铁部门负责
,对责任者要根据情节严肃处理。
第三条 森铁沿线城镇、农村社队、厂矿企事业、机关、部队、学校和集体单位,要与森铁部门密切配合,搞好联防,经常对沿线人民群众进行森铁安全常识和爱护森铁的教育,维护好森铁的正常铁序。
凡有下列行为之一,造成伤亡事故和森铁损失者,应由当事人或当事人所在单位负责:
1、在森铁路基、无人行道的森铁桥梁上和隧道内行走、乘凉、坐卧钢轨或行驶车辆;
2、在站内和区间内(两个车站之间)铁路上逗留、穿越、拣拾煤渣杂物或扒树皮等;
3、钻车、扒车、跳车、钻杆、跳栏和无票乘车;
4、在森铁路基两侧打晒农作物或在路基两侧各十五米内放牧牲畜;
5、一切车辆、拖拉机和行人抢越森铁道口。
盲、聋、呆傻人员,学龄前儿童,行动不便的老、残人员和精神病患者,在无人护送的情况下,横越森铁线路或无人看守的道口发生事故时,由其家属或看护人负责。
儿童、小学生因拆、动森铁设施,投、放障碍物造成伤亡和森铁损失的,由其家长负责。
森铁列车在运行中,撞轧无人看管的散放牲畜,造成森铁损失及牲畜伤亡的,由畜主负责。
第四条 凡发生路外伤亡事故,应立即采取紧急措施,进行处理。在区间发生的事故,列车司机和运转车长对事故现场要作出记录和标记,将伤者急送就近医院抢救,死者及时移出线路,尽快恢复正常行车,同时将事故情况报告邻站,并逐级上报森铁管理处和林业局。如伤亡者属非林
业职工家属,林业局还应立即报告所在地人民政府。
第五条 发生路外伤亡事故,应及时成立事故调查组,由林业局负责主持,各有关部门及伤亡者所在单位的代表参加组成。如伤亡者属非林业职工家属,还须有地方人民政府有关部门派人参加。遇有森铁列车与汽车、拖拉机相撞事故,交通监理部门必须派人参加。事故调查组的任务是
:调查事故情况,作好现场调查记录,查明事故原因,分析确定责任,研究防止事故措施,提出处理意见。
第六条 对路外事故伤亡者,按下列规定处理:
1、凡违反本规定有关条款所造成的伤亡,责任属于伤亡者本人或其所在单位的,伤者的医疗费、住院期间伙食费、补助费和粮票,由本人或其所在单位负担;因伤致残,家庭生活确有困难的,可根据其残废程度,由林业部门酌情给予一次性救济费一百至一百五十元。死亡者,林业部
门可给其家属一百至一百五十元丧葬补助费,家庭生活确有困难的,还可酌情给予一次性救济费一百至一百五十元。
2、凡属森铁方面责任造成伤亡者,其医疗费、丧葬补助费、住院期间的伙食补助费、医疗期间被停发的工资或工分,均由林业部门负担(其工资或工分可按本林业局职工平均工资付给),伤者住院期间吃饭所用粮票,应由本人交纳。同时,林业部门还要根据具体情况给予一次性抚恤
费,其标准是:成人(含应购买全票的儿童)最高不得超过一千五百元;应购买半票的儿童,最高不得超过七百五十元;应免票的儿童,死亡者只补助一百元以内的丧葬补助费,残废或丧失身体机能者,可比照半票儿童处理。
伤者住院,经会诊鉴定可以出院的,应及时出院,不得拖延。拒不出院者由伤者家属或单位负责领回,林业部门从鉴定出院日起不再支付其住院费用。确属无家可归或无户籍者,由当地民政部门收容。
3、持有效客票乘坐森铁客车的旅客或经批准并有便乘命令的便乘人员,及乘坐森铁专用工程列车执行施工任务的外包人员,因森铁部门责任而造成伤亡事故的,可按本规定的第六条2款处理。
4、借森铁自杀、他杀的,林业部门不承担任何费用。凡在林铁上从事各种违法活动造成伤亡的,一切费用自理,不得享受上述任何救济或补助,并应视违法情节予以罚款直至追究法律责任。
5、无人认领的尸体,由地方公安部门会同林业公安部门共同处理,费用由林业部门负担。
第七条 各种机动车辆通过森铁道口时,必须执行“一慢(停)、二看、三通过”的规定,严禁冒险抢行。凡通过森铁道口时发生撞车事故,责任属于一方的,其损失费用由负责一方负担;双方都有责任的,其损失费用由双方根据责任大小合理负担。非森铁道口,严禁任何车辆通过。

任何单位都不许在森铁沿线随意铺设道口,违者要追究责任,严肃处理。
第八条 在处理事故中,应做耐心细致的思想政治工作,任何人不得以任何借口防碍开通线路和森铁正常行车。对无理取闹、有意拖延、拒绝处理、影响森铁正常运输秩序和森铁人员正常工作的,由林业公安部门按有关法律和规定处理。对于制造事故,破坏森铁设施,扰乱森铁秩序的
反革命分子和刑事犯罪分子,必须坚决打击,依法严惩。
第九条 本暂行规定自批准之日起施行。



1982年7月5日

第62/99/M号法令:核准《公证法典》

澳门


第62/99/M号法令

十月二十五日

公证法典


现作公布之《公证法典》乃是跟随着澳门私法法律体系、公证法律体系及登记法律体系一直进行之深刻变革而出现者。该法典之主要目的为使公证实务能因应本地区经济、特别是受法律保护之交易在此世纪之交所面临之挑战而作出适当配合,尤其旨在将分散之法例加以集中及合成一体,并将进行公证行为之程序予以简化。
然而,作为澳门公证法特征之葡萄牙模式仍然存留,现行之拉丁公证制度之基本原则会维持不变,从而使该法典符合域内法就法律行为及合同之有效性方面、以及对仍受法律秩序承认具备公信力之公证文件之特别证明力方面所作之要求。
因此,现核准之《公证法典》构成了与受法律保护之交易灵活化相配合之法律行政框架,从而避免使某些并非由制度之安定性及公证行为应有之严格性与确实性所直接要求之制度性因素,成为本地区经济发展及现代化之障碍。
基于此;
经听取澳门律师公会意见后;
经听取咨询会意见后;
总督根据《澳门组织章程》第十三条第一款之规定,命令制定在澳门地区具有法律效力之条文如下:
第一条
(核准)
核准附于本法规公布之《公证法典》,此法典为本法规之组成部分。
第二条
(式样)
《公证法典》所指之簿册、印件及其它文书之式样,均由司法事务司司长在听取登记暨公证委员会之意见后以批示核准;上述式样应以两种正式语文作成。
第三条
(身分证明文件)
一、为着产生《公证法典》第六十八条第二款a项规定之效力,下列者视为等同于澳门居民身分证,只要其内含有持证人之照片:
a)葡萄牙共和国之国民认别证;
b)中华人民共和国居民身分证;
c)由澳门具有权限之实体所发出之驾驶执照;
d)由香港特别行政区具有权限之当局所发出之香港居民身分证明文件。
二、为着产生《公证法典》第一百六十条所指对照认定之效力,在第一款所指之文件中,仅接纳其内载有拟认定之签名样本之文件。
第四条 *
(对照认定)
一、法律规定中有作出对照认定之要求时,此要求得由要求出示居民身分证、同类文件或护照所取代;接收上述身分证明文件之部门之工作人员应在有关文件内注明身分证明文件之性质、编号、日期及签发实体。
二、如已遵守上款规定之要求,但仍被工作人员要求以对照认定方式对文件作认证,则该工作人员须负上纪律责任。
三、为第一款规定之效力,得出示该款所指文件之认证缮本。
* 已更改 - 请查阅:第4/2000号法律
第五条
(影印本)
一、废除对利害关系人在公证机构以外作成及为核对目的而提交予公证员之文件影印本之核对。
二、涉及应向本地区公共部门提交及在其内存盘之文件时,利害关系人得就所提交之文件要求在该部门作成影印本。
三、接收文件之公务员应核对影印本,并在其内注明及证实影印本与正本相符之声明。
四、如文件有明显不规范或涂改之处或其保存状况欠佳,则应在该文件之影印本内以可见之方式注明文件之缺陷、涂改或不规范之处。
第六条
(律师发出之证明)
一、在本地区执业之律师得就涉及单纯在法院之代理权之授权发出证明,以及就其本人作出或经宣誓之翻译所作出之文件译本发出证明。
二、如律师身为授权内所指之受权人,则不得就该授权发出证明;就授权发出之证明内应注明被代理人已声明知悉及接纳授权之内容。
三、如授权书系以被代理人不谙之语文作成,则须由一名由其选择之传译与其共同参与有关行为,此传译应就文件之内容向被代理人作出口头翻译,此事须在有关证明内载明。
四、就律师所作之翻译或在律师面前作出之翻译而发出之证明,适用经作出必要配合之《公证法典》第一百八十二条至一百八十四条之规定。
第七条 *
(笔迹资料卡)
公证机构原有之笔迹数据卡继续有效,并可供签名之对照认定之用。
* 已更改 - 请查阅:第4/2000号法律
第八条
(笔迹簿册)
一、对公证机构原有之笔迹簿册之处置,由司法事务司司长决定;在未定出其它处置前,应将该等簿册存于公证机构内。
二、在本法规开始生效后,公证员应停止使用尚在使用中之笔迹簿册,并应在十日内作出有关终结。
第九条
(簿册及数据库之计算机化)
一、司法事务司应促进簿册之计算机化,特别是登记簿册之计算机化,尤其以设立适当之计算机储存数据而为之。
二、上款所指之计算机储存数据应尽量以双语作成。
三、上两款之规定,经作出必要配合后,适用于《公证法典》第四十三条所指之公证机构数据库及中心数据库。
第十条
(废止性规定)
一、废止公布于一九六七年十二月三十日第52期《政府公报》副刊之一九六七年三月三十一日第47619号法令核准之《公证法典》,该法典系由公布于同一《政府公报》之一九六七年十二月十八日第23065号训令延伸至澳门适用;同时,亦废止所有对该法典作出修改之法律规定。
二、涉及由现核准之法典所规范事宜之所有单行法例亦予以废止,尤其系下列法令:
a)六月九日第51/84/M号法令;
b)因十一月二十八日第54/97/M号法令第六十三条第一款a项规定所作之保留而仍生效之九月八日第105/84/M号法令中之规定;
c)十二月三十一日第81/90/M号法令;
d)十二月三十一日第82/90/M号法令。
三、下列法令亦予以废止:
a)十二月三十一日第116/85/M号法令,以及该法令所附之公证手续费表;
b)三月八日第20/86/M号法令。
第十一条
(开始生效)
一、本法规及由其核准之《公证法典》,自一九九九年十一月一日起开始生效。
二、现核准之法典有关终审法院管辖权之规定,仅于终审法院开始运作之日方开始生效。
三、现核准之法典赋予中级法院之管辖权,在其开始运作前由高等法院行使。
四、因上条第三款之规定而产生之废止,仅在以训令核准之公证新手续费表开始生效之日方产生效力。
一九九九年十月二十日核准。
命令公布。
总督 韦奇立



关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知

动植物检疫局


关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知

          (动植检动字〔1996〕87号)

 

各直属口岸动植物检疫局、动物检疫所:

  近年来,鸵鸟的引进和繁养在我国呈现了迅猛发展的势头,为满足引进鸵鸟及其种蛋的需要,一年多来,我们先后与美国、加拿大、法国、荷兰、津巴布韦、博茨瓦那、澳大利亚和纳米比亚签署了进境鸵鸟的检疫和卫生条件议定书,从而为引进鸵鸟在检疫方面铺平了道路。随着鸵鸟的大量引进,我们的检疫工作也日趋繁重,而鸵鸟的检疫在我国还是个崭新的课题,为总结近年来进境鸵鸟的检疫经验,进一步提高检疫水平,防止疫病随进口鸵鸟及其种蛋传入我国,使鸵鸟的检疫工作更加规范化和标准化,保证进境鸵鸟检疫工作的顺利进行,现就进境鸵鸟及其种蛋入境后的检疫工作的有关问题通知如下:

  一、进境鸵鸟检疫

  1.鸵鸟入境后须在口岸动植物检疫局指定的隔离场所进行为期45天的隔离检疫

,如须延长隔离检疫时间,须报国家局批准。

  2.鸵鸟运抵隔离场一周后,逐只进行采血采样,并分成两份,其中一份保存备

查,并注意编号。

  3.隔离检疫期间的实验室检疫项目,主要依照我国与输出国缔结的鸵鸟检疫议

定书规定的实验室检疫项目进行。如发生特种情况可做特殊检疫项目。

  4.实验室检疫的操作试行程序附后。

  二、进境鸵鸟种蛋检疫

  1.进境种蛋的孵化厂须获得口岸动植物检疫机关的认可。

  2.进境鸵鸟种蛋在入孵前,须用有效的消毒药进行熏蒸处理。

  3.进境种蛋不得与其他种蛋一同孵化。

  4.首次孵出的小鸟须在口岸动植物检疫机关认可的场所由口岸检疫机关隔离检

疫30天,在此期间采样并依照我国与输出国缔结的鸵鸟种蛋的检疫议定书规定的项目作实验室检疫。

  三、其他未尽事宜按《进境动物检疫管理办法》执行。

  四、在执行过程中有何问题,请及时上报国家局。

  附件:鸵鸟疫病实验室检疫操作试行规程

 

                       中华人民共和国动植物检疫局

                         一九九六年八月二十六日

         鸵鸟沙门氏菌泄殖腔拭子培养规程(试行)

 

  一、材料:

  灭菌棉拭子、缓冲蛋白胨水、亚硒盐胱氨酸增菌液、胆硫乳琼脂、三糖铁琼脂、生化试验管、多价血清因子、细菌培养必需设备。

  二、操作方法:用无菌棉拭子从泄殖腔取样,放无菌瓶中,尽可能冷藏于2~4℃,编号后送实验室检验。

  三、实验室检验:

        ┌────────┐

        │  棉拭子样品  │

        └─┬──────┘

          │

    ┌─────┴─────┐

    │   缓冲蛋白胨水   │

    └───┬───────┘

    37℃ │18 ̄24hr

     ┌──┴───────┐

     │ 亚硒盐胱胺酸增菌液 │

     └─┬────────┘

    37℃│ 18 ̄24hr

       │

   ┌───┴───┐

   │ DHL培养基 ├────────────────┐

   └─┬─────┘                │

  ┌──┴───────┐           ┌──┴────┐

  │挑取可疑菌落划线接种│           │  可疑菌落  │

  └────┬─────┘           └──┬────┘

       │                    │

   ┌───┴────┐               │

   │ 三糖铁培养基 │               │

   └──┬─────┘          ┌────┴──────┐

      │                │  革兰氏染色,镜检  │

  37℃ │ 18 ̄24hr          │           │

      │                └────────┬──┘

    ┌─┴──┐                      │

  ┌─┤细菌鉴定├───┐                  │

  │ └────┘   │                  │

  │          │                  │

 ┌┴───┐    ┌─┴──────┐           │

 │生化试验│    │  血清学试验  │           │

 └─┬──┘    └┬───────┘           │

   │       ┌┴─────┐             │

   └───────┤综合判定结果├─────────────┘

           └─┬────┘

           ┌─┴────────┐

           │  试验结果报告  │

           └──────────┘

 

        鸵鸟鹦鹉热间接血凝(IHA)操作规程(试行)

 

  一、本规程适用于鸵鸟衣原体病的诊断。

  二、材料

    衣原体属抗原致敏绵羊红细胞

    标准阴、阳性对照血清

    被检血清:采集鸵鸟血清,试验前于56℃水浴灭活30分钟。

    90度V型反应板

    灭菌生理盐水

    微量加样器

  三、试验方法

  1.将生理盐水滴于V型反应板中,每孔50ul。

  2.取被检血清50ul于第一孔中,与生理盐水混匀后吸50ul于第二孔,依次作倍

比稀释至1∶16。

  3.将1∶8和1∶16两孔各加25ul抗原,如作定量试验可根据实际需要自行决定。

  4.对照试验:设阳性血清+抗原、阴性血清+抗原、生理盐水+抗原各一孔。

  四、血凝反应程度的标准:

  “++++”:红细胞全部凝集,形成一层均匀的膜,布满整个孔底。

  “+++”:红细胞在孔底形成一层薄膜,面积比前者稍小。

  “++”:红细胞在孔底形成薄层凝集,边缘松散或呈锯齿状。

  “+”:红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集,孔底有小圆点。

  “+”:红细胞沉于孔底,但周围不光滑或中心有空斑。

  “—”:红细胞完全沉于孔底,呈光滑的圆点。

  “++”以上的凝集判为阳性凝集。

  五、结果判定

  1.对照试验:出现如下结果试验方可成立,否则应重试,阳性血清+抗原呈“

++++”;阴性血清十抗原呈“-”;抗原十生理盐水

  2.被检样品判定标准:血清效价>1∶8(++)判为阳性。

 

      鸵鸟新城疫、禽流感、付粘病毒分离操作规程(试行)

 

  本规程适用于新城疫、禽流感、付粘病毒的分离

  一、材料

  1.消毒棉拭子

  2.灭菌试管

  3.灭菌生理盐水

  4.泄殖腔棉拭子保存液:PBS,PH7.2-7.4,青霉素1万单位/ml,链霉素10mg/m1,庆大霉素250ug/ml,制霉素5000u/ml。

  5.SPF种蛋。

  6.90度V型反应板。

  7.微量加样器。

  二、操作方法

  1.将采集的泄殖腔棉拭子置于样品保存液中,置4℃过夜。次日3000rpm离心10min,上清液作菌检后接种9~10日龄鸡胚(每胚0.2ml),37℃再孵育5天,去掉24小时死亡的鸡胚,其他鸡胚放4℃冷却后,检测鸡胚尿囊液的血凝滴度。如尿囊液

的血凝反应呈阴性,应再用鸡胚盲传2代。

  2.将收集的尿囊液用PBS以25ul量进行倍比稀释,加25ul的1%鸡红细胞,轻轻

混匀,静置15~30min,判定血凝滴度。

  如鸡胚尿囊液的血凝试验呈阳性,应分别用新城疫病毒、禽流感病毒、副粘病毒的阳性血清作血凝抑制试验以检测病毒的种类。

 

表一 鸡胚尿囊液血凝试验 (单位:ul)

 

┌─────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┐

│ 孔号  │  1  │  2  │  3  │  4  │  5  │  6  │  7  │  8  │  9  │  10 │  11│  12 │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│抗原稀释度│ 1∶2 │ 1∶4 │ 1∶8 │1∶16  │1∶32  │ 1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│1∶1024 │对照 │对照  │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│ 生理盐水│  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  50│  50 │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│ 抗原  │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │   │    │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│1%红细胞 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25│  25 │

└─────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┘

  室温15min,每5mim观察一次                    

┌─────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┐

│ 判定举例│++++  │++++  │++++  │+++   │  ++  │ -   │  -  │   - │  -  │  -  │  - │  -  │

└─────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┘


          禽流感血凝抑制试验操作程序(试行)

 

  一、试验材料

  1.抗原:禽流感病素H5、H7型抗原;

  2.阴、阳性对照血清。

  3.红细胞:无菌采集鸡血液5~10ml于少许阿氏液中摇匀,以洗涤3~5次,每次3000rpm离心10min,将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮,再将沉淀的红细胞稀释成1%的红细胞悬浮液(RBC);

  4.被检血清:采集被检鸵鸟血液,离心分离血清,56℃灭活30min;

  5.稀释液:灭菌的生理盐水或PBS(pH7.2~7.4)

  6.90度V型反应板,微量加样器。

  二、试验操作

  1.血凝试验(HA):

  取干净的微量滴定板(V型)一块,按表一进行操作:每孔加25ul生理盐水,孔

1加禽流感抗原25ul,用移液器反复吹打混匀三次;吸出25ul于孔2,吹打混匀后吸出25ul于孔3;如此依次稀释到孔10,孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原

,只加生理盐水作空白对照。加入1%的红细胞悬浮液25ul,充分振荡后置于室温;

每5min观察一次,15~30min后判定结果,并作好记录。

 

表一 禽流感血凝试验 (单位:ul)

 

┌─────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 孔号  │  1 │  2 │  3 │  4 │  5 │  6 │  7  │  8  │  9  │  10 │  11│  12│

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│抗原稀释度│ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│1∶16 │1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│1∶1024 │对照 │对照 │

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│生理盐水 │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  50│  50│

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 抗原  │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25 │   │   │

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│1%红细胞 │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  25│  25│

└─────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘

  室温15min,每5min观察一次            

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│ 判定举例│  + │  + │ +  │ +  │ +  │ +  │  +  │  -  │  -  │  -  │  - │  - │

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  抗原的血凝滴度是凡能使1%的鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数;因此,

能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液25ul称为1个血凝单位(HA)。如该抗

原的血凝单位为1∶128/25ul。

  在进行禽流感血凝抑制试验时,病毒的工作浓度应为8HA。因为该试验的抗原的

血凝单位为1∶128/25ul,按其孔号数(孔.7)倒退3孔的稀释倍数(孔4 1∶16)

,作为该病毒的工作浓度:1∶16/25ul。

  2.血凝抑制试验(HI):

  取干净的微量滴定板(V型)一块,按表二进行操作:每孔加25ul生理盐水,孔

1加待检血清25ul,用移液器反复吹打混匀三次;吸出25ul于孔2,吹打混匀后吸出25ul于孔3;如此依次稀释到孔8,孔8混匀后吸出25ul弃掉。孔9作为阳性血清对照,孔10作为阴性血清对照,孔11不加任何血清而作为抗原对照,孔12不加抗原和任何血清,只加PBS作空白对照。各孔加入1%的红细胞悬浮液25ul,充分振荡后置于室温;每5min观察一次,15~30min后判定结果,并作好记录。

  未免疫的健康鸵鸟血清无血凝抑制作用,各稀释倍数均出现红细胞凝集现象;禽流感感染或免疫的鸵鸟血清能抑制禽流感病毒对红细胞的凝集作用。凡能使8HA的

抗原凝集红细胞作用完全抑制的血清最高稀释倍数,称为该血清的血凝抑制价(如表二的血凝抑制价为1∶64)。

 

表二 禽流感血凝抑制试验 (单位:ul)

 

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│ 孔号   │  1 │  2 │  3 │  4  │  5  │  6 │  7  │  8  │  9  │  10 │  11│  12│

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│血清稀释度 │ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│ 1∶16 │ 1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 阳性 │ 阴性 │抗原 │对照 │

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 生理盐水 │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  50│  75│

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 被检血清 │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  (25)│  (25)│   │   │

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 8HA抗原  │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  25│   │

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  室温感作5~6min                                           

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│ 1%红细胞 │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  25│  25│

└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘

  室温15min,每5min观察一次                                      

┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 判定举例 │  - │  - │  - │  -  │  -  │ +  │  +  │  +  │  +  │  +  │  + │  + │

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  3.判定标准

  1)判定时应首先观察各对照孔是否完全符合;

  2)红细胞凝集:红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底,

判为血凝作用为阳性“十”;

  3)无凝集或凝集抑制:红细胞集中于孔底中央呈点状,判血凝作用为阴性“—

”,或判血凝抑制作用为阳性;

  4)血凝抑制价:凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀释倍数;

  5)被检血清的血凝抑制价在1∶8以上者,判为阳性反应;

  6)最后判定时间与感作时间有关。温度高时感作时间短,15min即可;温度低时可适当延长,但最长不得超过30min。

 

          禽流感琼脂扩散试验操作规程(试行)

 

  1.琼脂凝胶平板的制备:称取琼脂糖1g,氯化钠8.5g,加入100ml蒸馏水,10磅10分钟高压溶解后,冷却至45℃,加入0.01%叠氮钠,每个直径6CM平皿加7ml融化琼脂,厚度为2.8mm,待凝固后置冰箱内片刻。

  2.打孔:中间一孔,周围六孔为一组,孔径3mm,孔居2.5mm。

  3.加样:中心孔加抗原,周围1、3、5孔加阳性血清,2、4、6孔加被检血清。

  4.加样后置湿盒内,于室温下感作。

  5.结果判定:24小时初判,48小时终判,阳性对照成立时,进行判定。

  阳性:被检血清孔与抗原孔之间出现致密沉淀线,并与标准阳性血清的沉淀线末端互相联接。

  可疑:标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲。

  阴性:抗原孔与被检血清孔之间不出现沉淀线或标准阳性血清与阳性孔间的沉淀线向毗邻的被检血清孔直伸或其外侧偏弯。

 

           禽副粘病毒血凝抑制试验操作程序

 

  一、试验材料

  1.抗原:禽副粘病毒病毒Ⅱ型抗原;

  2.红细胞:无菌采集鸡血液5~10ml于少许阿氏液中摇匀,以洗涤3~5次,每次3000离心10min,将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮,再将沉淀的红细胞稀释

成1%的红细胞悬浮液(RBC);

  3.被检血清:采集被检鸵鸟血液,离心分离血清,56℃灭活30min;

  4.稀释液:灭菌的生理盐水或PBS(pH7.2~7.4)

  5.阴、阳性对照血清

  6.90度V型反应板,微量加样器。

  二、试验操作

  1.血凝试验(HA):

  取干净的微量滴定板(V型)一块,按表一进行操作:每孔加25ul生理盐水,孔

1加禽流感抗原25ul,用移液器反复吹打混匀三次;吸出25ul于孔2,吹打混匀后吸出25ul于孔3;如此依次稀释到孔10,孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原

,只加生理盐水作空白对照。加入1%的红细胞悬浮液25ul,充分振荡后置于室温;

每5min观察一次,15~30min后判定结果,并作好记录。

 

表一 禽副粘病毒血凝试验   (单位:ul)

 

┌──────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬─────┬───┬───┐

│ 孔号   │  1 │  2 │  3 │  4 │  5 │  6 │  7  │  8  │  9  │  10  │  11│  12│

├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤

│抗原稀释度 │ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│1∶16 │1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│ 1∶1024 │对照 │对照 │

├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤

│ 生理盐水 │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25  │  50│  50│

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│ 抗原   │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25  │   │   │

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